Mănăstirea este atestată documentar din 1407, însă rădăcinile în timp ale activității monahale se întind până în veacul al XII-lea. Ctitorirea mănăstirii îi este atribuită voievodului Petru I Mușat(1375-1391), care a construit aici prima biserică din piatră, astăzi dispărută. Pe amplasamentul mănăstirii existase însă o bisericuță și mai veche, din lemn, numită Biserica Albă, construită de monahi cu un secol înainte. Biserica actuală din incinta mănăstirii a fost ctitorită de voievodul Ștefan cel Mare la sfârșitul secolului al XV-lea și are hramul Înălțarea Domnului.

În vara anului 1933 intra ca viețuitor al Mânăstirii, Ilie, fiul lui Maxim și al Ecaterinei Iacob. Acesta va deveni mai târziu Sfânul Ioan Iacob Românul de la Hozeva.

În anul 1948 au fost ridicați și închiși la Mănăstirea Neamț 25 de clerici superiori români uniți (greco-catolici), între care viitorii episcopi Ioan Cherteș și Tit Liviu Chinezu. Conform memoriilor profesorului Eugen Popa, unul din cei arestați, la Neamț au fost căutați de Teoctist Arăpașu, care le-a cerut să treacă la BOR, avertizându-i că „dacă nu acceptați, patriarhul își va lua mâna protectoare de pe capetele voastre.”În februarie 1949 internații de la Mănăstirea Neamț au fost transferați la Mănăstirea Căldărușani, lângă București.